مهندسی ژنتیک گیاه به منظور بیان پلی هیدروکسی بوتیرات در کلروپلاست توتون

مهندسی ژنتیک کلروپلاست چندین مزیت منحصر به فرد نسبت به انتقال ژن به هسته ارائه می دهد. بیان بسیار بالای پروتئین های نوترکیب، درون سیستم های مهندسی شده پلاستیدی، روشی موثر و ارزشمند را برای استفاده از گیاه به عنوان بیورآکتور مطرح می کند. در این تحقیق با طراحی و ساخت ناقل های مناسب عمومی و اختصاصی برای انتقال ژن به کلروپلاست گیاهان، تلاش شد تا گام موثری به عنوان گزینه ای جایگزین برای تراریزش هسته ای برداشته شود. لذا با استفاده از آنالیزهای بیوانفورماتیکی ژنوم های پلاستیدی موجود در بانک های اطلاعاتی، قسمتی از توالی پلاستوم به عنوان توالی هدف گیری کننده ژن خارجی به ژنوم کلروپلاستی انتخاب گردید که دارای طول مناسب برای ایجاد نوترکیبی همولوگ و الحاق در پلاستوم، ناحیه آغاز همانندسازی اختصاصی پلاستوم، هدف گیری ژن در ناحیه تکرار معکوس پلاستیدی و جایگاه های آنزیمی منحصر به فرد در مرکز توالی برای الحاق ژن خارجی باشد. توالی های مجاور یا هدف گیری کننده با طراحی یک جفت پرایمر از نواحی حفاظت شده مورد نظر از پلاستوم های توتون و 7 گیاه دیگر، جداسازی و کلون سازی شد. سپس با افزودن نواحی تنظیمی مختلف شامل پیشبرها و پایانبرهای دائمی کلروپلاستی و القایی، نواحی بدون ترجمه یا utrهای مناسب، نواحی اتصال ریبوزوم پلاستیدی، جایگاه های آنزیمی مناسب ورود ژن برای بیان انفرادی و یا پلی سیسترونی، ژن گزارش گر، ژن های نشانگر انتخابی آنتی بیوتیکی و غیرآنتی بیوتیکی و توالی هایی برای حذف ژن نشانگر پس از انتقال ژن، تلاش شد تا انواع مختلفی از حامل های کلروپلاستی ساخته شوند تا بتوان بیان هر ژن خارجی را به طور دلخواه در ژنوم های پلاستیدی گیاهان مختلف به صورت کارا امکان پذیر نمود. صحت ساخت ناقل های کلروپلاستی توسط آنالیزهای ملکولی مختلف تایید گردید. از سویی دیگر جداسازی و ساخت کاست بیانی برای گروه ژنی (اُپران) پلی هیدروکسی بوتیرات (phb) و کلون سازی آن در ناقل بیانی و ناقل های کلروپلاستی به منظور انتقال آن به ژنوم پلاستیدی برای دستیابی به تولید ارزان پلیمر پلی هیدروکسی بوتیرات به عنوان پلاستیک زیست تخریب پذیر که دارای بسیاری از ویژگی های پلاستیک های نفتی بوده و دارای کاربردهای صنعتی مهمی نیز نظیر ساخت کپسول های قابل تجزیه زیستی برای رهاسازی دارو در دراز مدت، نخ بخیه، بیوپلیمر جایگزین استخوان و غیره، می باشد، انجام گرفت. صحت جداسازی و کلون سازی و بیان هر سه ژن اُپران phb توسط آنالیزهای مختلف pcr، هضم آنزیمی و کروماتوگرافی گازی تایید گردید و در نهایت پلیمر مذکور توسط باکتری های نوترکیب ساخته شده در این تحقیق تولید و استخراج گردید. از سویی دیگر سیستمی با قرار دادن پیشبر شوک حرارتی e. coli (groe) در ناقل پلاستیدی و ساخت سیگما فاکتور هیبرید گیاه- باکتری تحت یک پیشبر مختص بافت طراحی گردید تا بتوان بر مشکل کاهش رشد و یا باروری گیاه در انتقال ژن به پلاستید که اغلب به دلیل اثرات تولید دائمی محصول تراژن ایجاد می گردد نیز غلبه نمود. به طوری که با ترکیب موتیف های قسمت n-ترمینال شبه سیگما فاکتور توتون که علاوه بر توالی نشانه برای ورود به کلروپلاست دارای موتیف برهمکنش با پلیمراز کلروپلاستی می باشد با موتیف های قسمت c-ترمینال فاکتور سیگما 32ی e. coli که قدرت تشخیص و اتصال به پروموتر groe را دارد، یک فاکتور سیگمای هیبرید گیاه e. coli طراحی گردید. این موتیف ها با طراحی پرایمر از توالی نوکلئوتیدی فاکتور سیگمای باکتری و گیاه تکثیر شد و اتصال آنها به هم با استفاده از soeing pcr طوری انجام گرفت که چهارچوب باز خواندنی (orf) اصلی در فاکتور سیگمای هیبرید حاصل حفظ گردد. سپس این ژن هیبرید موسوم به hsig طی مراحلی به منظور اختصاصی کردن بیان ژن در پلاستیدهای گیاهی با افزودن نواحی تنظیمی در وکتور اگروباکتریومی پس از حذف ژن نشانگر انتخابی کلون سازی شد. از وکتور نوترکیب حاصل برای انتقال ژن به رقم ایرانی توتون استفاده گردید و ردیابی گیاهان تراریخته باززاشده روی محیط غیرانتخابی توسط آنالیز pcr انجام شد. الحاق ژن hsig و کپی شمار آن در ژنوم گیاه تراریخته به ترتیب توسط آنالیزهای سادرن بلات و real time pcr تعیین شد. بیان ژن hsig و هدف گیری آن به پلاستید توسط بیان ومشاهده پروتئین فلورسنت سبز (gfp) پس از انتقال کاست بیانی طراحی شده برای gfp تحت پیشبر groe در ناقل pfngi به کلروپلاست توتون توسط تفنگ ژنی اثبات شد. سپس سه ژن اُپران phb جایگزین gfp در ناقل کلروپلاستی گردید و توسط دو ناقل pfnpi و pfnp به پلاستید توتون منتقل شد. آنالیز pcr حضور اُپران را در گیاهان ترانسپلاستومی حاصل تایید نمود. سیستمی که برای بیان phb در ژنوم کلروپلاستی طراحی و ساخته شد این قابلیت را خواهد داشت که با جایگزینی هر ژن دلخواه دیگری به جای phb استفاده و به عنوان زمینهای کارا و سازگار با مسائل زیست محیطی و برای ایجاد صفات مطلوب زراعی و نیز تولید پروتئینهای درمانی، واکسنها و مواد زیستی، به کار رود.